冷凍保存における再結晶の問題を解決するための音波 - 南昌ホライゾンイノベーション株式会社

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7603 (2023) この記事を引用

615 アクセス

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

臓器のバイオバンキングは、凍結保存の懸案事項です。この問題は多面的ですが、ここ数十年の進歩は主に、凍結保存されたサンプルの迅速かつ均一な再加温の達成に関連しています。これは、凍結保護剤の毒性研究に加えて、過去に主に研究された物理的な課題であり、大幅な進歩も示されています。この論文は、線虫 Caenorhabditis elegans に基づいて、そのような機能を実行できる技術、つまり高密度焦点式超音波の原理証明を示します。したがって、再結晶の問題を回避して、成虫の状態で− \(80\;^\circ{\rm C}\) で保存されたこの虫は、高密度焦点式超音波で加熱された後、体系的に生き返らせられました。 (HIFU) 波。このテクノロジーの大きな利点は、スケーラブルであることです。さらに、再加温は MRI サーモグラフィーによってリアルタイムで監視でき、音響干渉計によって制御できます。私たちは、私たちの発見が、ミリメートルスケールの系の凍結保存に使用できる再加温への可能なアプローチの出発点であると期待しています。単独で、またはナノ加温や誘電加熱などの他の有望な加熱方法と組み合わせて、現在の技術は新しい方法を提供します。冷凍保存における再結晶の問題の物理的側面を解決し、より大きなサンプルの長期保存への扉を開きます。

低温で臓器をバンクに保存することは、数え切れないほどの可能性をもたらします1,2。現在、この可能性はとらえどころのないままで、ウサギの腎臓、羊の卵巣、肝臓など、部分的かつ孤立した成功例がいくつかあるだけです 3,4,5。さまざまな冷凍保存戦略がありますが、臓器の長期極低温保存では、最終的に現れる氷の結晶によって引き起こされる損傷がこの状況の主な原因です。次の段落では、凍結保存の一般的な文脈の中で問題を組み立てていきます。次に、なぜ急速かつ均一な再温暖化がこれを回避できるのかを理解します。最後に、高密度焦点式超音波がどのようにソリューションを提供できるかを見ていきます。

Luyet6 はすでに 1940 年に、氷が十分な速度で現れるゾーンを通過するだけで生物系のガラス化が可能であることをよく理解していました。これは図 1 に象徴的に表されています。温度が上昇または下降すると、ある段階から別の段階に移行します。ただし、温度変化が十分に速い場合は、特定のフェーズをスキップできます。したがって、結晶状態を経ることなく、液体からガラスに、またその逆に進むことができます。このためには、この遷移の特性時間が、氷の核生成と成長に必要な特性時間より短ければ十分です。

水系の相変化に対する冷却速度と昇温速度の影響。横軸は温度をケルビン単位で表し、4 つの状態 (ガラス、結晶、液体、気体) 間の転移温度を Tglass (ガラス転移温度)、Tmelt (融解温度)、Tboil (蒸発温度) として示します。この軸は両方向に移動でき、マークされた温度を超えるときの状態の変化に対応します。縦軸は温度変化の速度を表します。前述の 4 つの状態に対する系の分子の配置を例示的に示します。この図では、マークされた温度を通過する速度が特に興味深いものであり、液体からガラス状態への変化という私たちにとって関心のあるトピックに最も関連しています。液体からガラス相へ、またはその逆への温度変化が遅すぎる (縦軸の低い値) 場合は、結晶相を通過する必要があることを意味し、水系では氷の形成を意味します。代わりに、高い冷却速度および/または昇温速度 (縦軸の高い値) は「結晶」領域をバイパスし、液体状態とガラス状態の間で直接変化を与えます。

Luyet 氏が遭遇した問題は、数十ミクロンを超えるシステムではそのような冷却速度と温暖化速度に到達できないことが多いということでした。彼は、溶質を添加することでこれらの速度を低下させることができることを認識していましたが、別の方法、つまり熱伝達を改善することでこれらの速度を達成しようとする方法を模索することにしました。したがって、このプロセスを通じて彼は少数の小さな生物学的システムしか救うことができませんでした。

グリセロール 7 が発見されるまで、これらの速度が技術的に実現可能な範囲内であることがわかりました。このためには、細胞外の氷によって引き起こされる脱水が不可欠です8,9。これは、現在何千もの研究室で使用されている緩速凍結として知られる技術です。

その後、他の凍結保護剤の登場により、ゆっくりとした凍結に代わる方法が開発されました。これらは、細胞内部のガラス化を達成するために細胞外の氷を必要としません。細胞の内側と外側の両方に氷が完全に存在しないため、ガラス化技術の総称が付けられます。この場合、平衡ガラス化と非平衡ガラス化を区別するのが一般的です。 Farrant10 以降の平衡ガラス化では、温度が低下するにつれて凍結保護剤の濃度が増加し、ゆっくりとした凍結における細胞外氷の効果をある程度模倣します。毒性を考慮して 11,12、各温度における凍結保護剤の量は、固液熱力学的平衡図に従い、氷の形成を避けるのに十分な最小限に保たれます。したがって、その名前は10、13、14、15です。対照的に、非平衡ガラス化として知られる技術では、すべての凍結保護剤が最初から添加されるか、またはより少ないステップ数で添加されますが、通常は常にゼロ以上の温度で、単に浸すだけでガラス化に達することができる濃度で添加されます。液体窒素中のサンプル16,17。もちろん、中間の戦略もあります。それらでは、凍結保護剤の濃度は状態図の線に従わず、過冷却の可能性と毒性の限界の間の境界線内に留まります 3,18。あるいは、氷の適度な外観で人生の互換性を試すこともあります19、20。ここで私たちが懸念していることに焦点を当てて要約すると、次のとおりです。(1) 凍結保存技術は、システムが各温度に対して持つ凍結保護剤の量が基本的に互いに異なります。 (2) 凍結防止剤の量は、氷の形成を避けるために図 1 のこのゾーンを両方向に横断する必要がある位置、幅、および速度を決定します 21。 (3) いずれの場合でも、その毒性を考慮して、凍結保護剤の量は最小限に抑えられます。これらすべてを踏まえて、今日の問題は、物質移動、熱伝達、凍結防止剤の毒性という 3 つの要素の最適化に焦点を当てています。そして、ここでシステムの形状と寸法が根本的に関係し、結果的に臓器の凍結保存の難しさの原因になります。小さなシステムでは、非常に高い冷却/加温速度を達成できるため、集中力を維持することができます。凍結防止剤の低濃度22。しかし、システムが大きい場合、毒性と熱伝達の間のバランスに達することがより困難になるため、徐冷23とガラス化4,24の両方で氷が致命的な形で現れることがよくありますが、一般にパラメーターは非常に異なります。しかし、問題の原因は 2 つのケースで基本的に同じです。

逆説的ですが、温暖化中よりも冷却中の方が、致死的な氷結晶の形成を回避するのが容易です21。この奇妙な挙動の起源は、結晶の出現には核形成と成長という二重の必要性が存在することにあります。成長には低粘度が必要なため、高温で優先的に発生します。ただし、核生成は非常に低い温度で発生する可能性が最も高く、通常は Tg (通常、溶液では \(\sim -100 \; ^\circ{\rm C}\) および \(\sim -47 \; ^\circ{ \rm C}\) セルの場合25)。したがって、系が冷えると、最初に「成長ゾーン」を通過しますが、現時点では「成長するものは何もありません」(まだ原子核はありません)。その後初めて核形成ゾーンに到達し、成長しない小さな氷の胚が出現する可能性があるため、原則として致命的ではありません。最後に、システムはガラス化されて保存されます。ただし、再加熱すると再結晶化 (または失透) が発生する可能性があります26。再加温は、新しい胚の出現の可能性を伴う高核形成ゾーンを通過することによって始まります。実際、Boutron27 は、非晶質状態からの再加熱では、液体状態からの冷却よりも \({10}^{6}\) から \({10}^{12}\) 倍多くの原子核が存在することを指摘しました。最後に、再び成長ゾーンを通過し、致死的なサイズに成長する可能性のあるかなりの数の日和見核が存在することになります。これらの結晶は、「再温暖化中」と呼ばれるほど数が多くなり、温度が上昇するにつれて成長が促進されます28。この成長を避ける方法は、このエリアを素早く通過することです。このため、高い温暖化速度が重要であり、ある意味では冷却速度よりも重要です。最近、再温暖化の関連性が冷凍保存のパラダイムシフトとして注目されるようになりました 24。興味のある読者は参考文献で、この段落で展開されたトピックの深く詳細な分析を見つけることができます29。

この研究のように、徐冷によって凍結保存された系では、ガラス化とは対照的に、再結晶化の問題、およびその結果としての高い昇温速度の必要性が、あらゆる種類の状況で一貫して確認されています。これにより、適正製造プロセス (GMP) 内で高い温暖化率が推奨されるようになりました 30,31。したがって、この方法で、精子 32 から血液バッグ 30 までの範囲のサンプル (細胞治療における凍結バイアルも含む 33) のサンプルで再結晶化がどのように回避されるかはよく知られています。最近、CAR-T34 に関連して興味深い事例が研究されています。そこでは、極低温顕微鏡法と熱量測定の共同研究により、再結晶化を回避するための高い温暖化速度の利点が確認されています。

高速の再温暖化を達成するために、その透過能力を考慮して、原理的には拡張可能な電磁場のさまざまな応用形態が提案されている。この申請は、直接的に 35、36、37、38 または仲介エージェントを通じて間接的に 39、40、41 のいずれかで行われています。この問題に関しては、最近重要な進歩が見られました42。さまざまな体積加熱方法を比較した表は、補足情報にあります。

同様に透過性のある 43 電磁場の代替手段として、高密度焦点式超音波 (HIFU) 44 があります。 HIFU の応用の起源は 192745 年に遡り、研究者らはすでに、HIFU が幅広い研究の可能性を秘めた分野であると話し合っていました。 15 年後、最初の腫瘍はこれらの波によって生成された強烈な熱によって焼かれていました 46。しかし、NMR47 が開発されて初めて、画像技術により MRI サーモグラフィーに基づいた HIFU 制御が可能になりました。現在では、さまざまな状況下で多くの組織の 3D 熱画像を取得できる幅広い MRI 構成 (シーケンス) が利用可能です48。一方、超音波の減衰と透過性は周波数の関数であることに注意してください（たとえば、1 MHz では、超音波は 7 cm の軟組織を伝播するときに約 50% 減衰し、2 MHz では超音波が伝播するときに約 50% 減衰します）。 MHz では、同じ組織によって波は初期値の約 25% に減少します 43)。したがって、大きなサイズのサンプルの場合は、トランスデューサのアレイを用意することをお勧めします。これにより、各チャネルの波の相対位相を制御し、生体材料の変化や不均質性（亀裂、氷、 …）リアルタイムで。この研究では、1 つのトランスデューサー (mm サイズのサンプル) だけを使用しました。以前のコンピューターシミュレーションでは、26 個のトランスデューサー (cm サイズ) を調査しました 44。今日では、数千のトランスデューサーで作られた装置が一般的であり、多くの医療療法において 10 分の 1 度を超える精度での加熱が可能です 49。

私たちの研究グループは最近、冷凍保存における再加温のための HIFU のコンピューターシミュレーションの結果を発表し、本研究での実用化を約束しました。このために、原理の証明として C. elegans を使用しました。 C. elegans の従来の冷凍保存 23,51 は再結晶化の問題の影響を受けており、最小の幼虫段階である L1 および L2 では低い回収率 (35%) が維持され、成虫段階では実質的にゼロに保たれています 51。しかし、再温暖化が急速である場合、これは起こりません52。次の行では、このワームに基づく再結晶化の問題を回避するための HIFU の提示を初めて示します。このために、N2 線虫は通常の条件 \(20\;\mathrm{^\circ{\rm C} }\) で培養されました。少なくとも 5 世代後に個体群が安定したので、凍結保存プロセスが実行されました。復温のために常に 2 つのグループが作成されました。標準的な方法で復温された対照グループ 23,51 と、超音波で復温された実験グループです。次の段落では、克服する必要があった技術的課題、実行された実験の詳細、そして最後に得られた結果について説明します。

前述したように、実験を実行する前に、一連の実際的な課題に対処する必要がありました。したがって、HIFU デバイスは、それぞれのドライバーを備えた 4 つのパワートランジスタ、1.22 MHz 発振器、マイクロコントローラー、およびさまざまな受動素子を使用する方形波発生器から構築されました。この波形発生器は、外部電源から供給される最大 200 W のトランジスタブリッジ電力を受け入れ、HIFU トランスデューサに励起を供給します。 HIFU トランスデューサは、曲率半径 50.8 mm、キャップ深さ 10 mm の PTZ-8 球形キャップで、圧電効果に基づいて、方形波電気励起を機械振動、つまり圧力波に変換します。振幅は次のとおりです。使用される電力の平方根。キャップは、図 2a に示す密閉チャンバー内にあります。セラミックキャップの共振周波数は1.5MHzでしたが、図2bに示す発電機出力に見られるように、発電機トランジスタで起こり得るクロスオーバーを克服するために、より低い周波数で供給されていました。超音波が集中する焦点は、トランスデューサーの形状と寸法に依存し、ボロメーターを使用したサーモグラフィー、感熱フィルムを使用したサーモグラフィー、熱電対を使用した 3 つの異なる方法で個別に決定されました。測定では、焦点領域の中心が位置する Z 軸上の距離を決定しようとしました。正確な値を取得するために、FDM CREALITY Ender 3-Pro プリンターのステッピングモーターを使用して、熱電対先端の位置を 100 µm の精度で制御しました。キャップの表面からさまざまな距離で実行された熱実験（図S5を参照）により、キャップに対して50.8 mmの焦点の位置が得られ、これが最大加熱点です。これは、上で詳述したトランスデューサの幾何学的形状に従って予想されるものと完全に一致しています。

高密度焦点式超音波装置の特性評価。 (a) HIFU トランスデューサーのセクション。 A～D: PVC シャーシ。キャップの後ろに構造、密閉性、空気室を提供します。Ｅ：キャップ外面の導電膜。Ｆ：キャップ内面の導電膜。 G：エポキシシーラント（外部および内部）。 H: 電源同軸ケーブル。 J: 空気室。 K: PTZ-8 セラミックボールキャップ。 L: 浸入時の空気室のドレンプラグ。 (b) 外部ソースからの電力供給がない方形波発生器の出力。信号周波数は 1.22 MHz、振幅は 18 V ピーク-ピークです。 (c) 外部電源のさまざまな電圧と電流で HIFU を使用して加熱することによって得られた温度曲線。ショットは 60 秒間の露光で正規化されました。得られた温暖化率は外部電源の電力供給に依存しました。ピエゾの公称電力は 25W であるため、それ以下で動作させると (20 V および 0.68 A の曲線の場合)、パフォーマンスが低下します。 (d) 超音波加熱の焦点領域の詳細。熱伝達は、寸法 12 × 15 mm の卵形領域で最大になります。これらの値は、感熱フィルムを使用したサーモグラフィーによる実験から得られ、その例を (e) に示します。 (e) 室温の水中での HIFU による加熱のサーモグラフィープロファイル。加熱により、断面内に焦点に関して同心円が生成されます。最も暑い点と最も寒い点の間では、常に \(10 \;^\circ{\rm C}\) 未満の温度差が記録されます。

波形発生器の DC 電源の電圧 (20 ～ 60 V の範囲) と電流 (680 mA ～ 2.26 A の範囲) を変化させて、図 2c に反映されている加熱曲線がトランスデューサーによって得られました。供給電力。さまざまな供給電力でデバイスが達成した加熱速度は、およそ 14 ～ 218 \(^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) の間でした。次に、再温暖化中の任意の瞬間において、任意の 2 点間の最大温度差が常に \(10 \; ^\circ{\rm C}\) 未満となる体積として、焦点領域の形状が特徴付けられました。これにより、寸法 12.4 × 15.4 mm の卵形が得られました。これらの値は図 2d および e に示されています。

凍結保護溶液に浸した線虫の全個体群が超音波焦点内に確実に閉じ込められるようにするには、特別に設計された小さな容器に線虫を凍結保存する必要がありました。前記容器は、ペトリ皿内に構築された中空のウェルからなり、残りの充填剤として寒天を使用した。その詳細を図 3d に示します。ウェルの寸法は、直径 9 mm、深さ 6 mm と決定され、焦点卵形の寸法より小さくなりました。寒天を通した凍結保護培地の漏れがないことを保証するために、ウェルの壁をイソプロピルアルコールのフィルムで覆った。処理の有効性は、これらのウェルの透過性実験によって確認され、染色としてのフェノールレッドが寒天を通過するか否かによって明らかになった。これらのカスタムウェルは、単に私たちの形状に適合した閉じ込めコンテナとして機能します。超音波を伝達できる限り、代替の材料や形状も利用できます。最後に、冷却する前に、プレートは常に蓋で閉じられ、パラフィルムで密封されました。これにより、サンプルが分離されるため、GMP に準拠した当社のテクノロジーの使用が可能になります。超音波による再加温では、トランスデューサーからサンプルに音波を伝達するための液体媒体としてエチレングリコールが選択されました。この培地は、十分に低い温度でも液体状態を維持することにより、線虫を最初は − \(80 \; ^\circ{\rm C}\) に維持できます。

C. elegans の冷凍保存と実験セットアップの熱履歴。 (a) ゆっくりとした凍結プロセス、\(- 80 \; ^\circ{\rm C}\) での保存 (グラフ内の「ギャップ」で表される)、および HIFU 加熱による回復時の温度曲線。サンプルは室温で開始し、凍結保護溶液中で 10 分間インキュベートした後、\(- 80 \; ^\circ{\rm C}\) の冷凍庫に入れて \(- 0.6 \; ^ \circ{\rm C} /\mathrm{min}\)。その後、48 時間保存し、保存温度から直接超音波加熱によって \(-5 \; ^\circ{\rm C}\) 程度の温度まで回復します。 (b) A を示す実験設定: \(-70 \; ^\circ{\rm C}\) のエチレングリコール浴。 B: HIFU トランスデューサー。 C: PLA のプレートサポート。 D: ペトリ皿 (中央にくぼみがある) を覆い、パラフィルムで密封し、逆さにした。 E: 外部温度計。 F: 方形波発生器。 G: 外部電源。 (c) CAD でモデル化された実験セットアップの 3D 断面図。この画像では、サポートの機能とその使用法がよりよく理解されています。タグは画像 (b) と共有されています。 (d) 直径 50 mm のペトリ皿内の寒天ウェルの詳細。プレートは、超音波に曝露されるように 3D サポート上に配置されるように、反転して提示されます。

HIFU トランスデューサーの凹面部分を槽に浸す必要があるため、望ましくない気泡が頻繁に発生しました。これらは、エチレングリコールに浸したガス吸引器によって除去されました。最後に、実験の再現性と加熱サンプルに対する焦点の位置の安定性は、ペトリ皿とトランスデューサーをしっかりと収容して固定する 3D プリントされたポリ乳酸 (PLA) サポートの構造によって保証されました。 CADとFDM技術を使用して製造されています。図 3b と c は、製造されたプレートで HIFU を使用するための実験セットアップを示しています。故障モードと加熱の実用性の詳細については、補足情報を参照してください。

上記のセットアップ全体の物理的パフォーマンスは、音響パッケージと熱伝達パッケージを併用し、有限要素 (Comsol Multiphysics v6.7) を使用して計算的にモデル化されました。これらのコンピューターシミュレーションの結果は、実験的に見つかった温暖化速度と同様に、焦点の位置とその寸法の両方を裏付けました。実験の 2D ビューの音圧場と温度場をそれぞれ図 4e と図 4f に示します。図 S10 は、60 秒間の温暖化シミュレーション中の等温線の概要を示しています。

結果のプレゼンテーション。 (a) 加温速度と曝露時間に応じた HIFU による生存率。温暖化速度が低いと、線虫の回復において悪い結果が示されます。実験は常に \(\sim 200\) 線虫のグループを含むプレートを使用して行われました。これらは以下の平均構成を示した: L1 段階の個体が 20%、L2 の個体が 30%、L3 の個体が 25%、L4 の個体が 15%、成人が 10%。最適なパラメーターの場合、L4 および成体よりも多くの L1 ～ L3 線虫が回収されたため、成長段階ごとの生存率は均一ではありませんでした。 L4生存率は70%でした。成人の生存率は 40 ～ 60% でした。 (b) と (c) 最高の温暖化率 \(157.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) と \(217.8 \;^\circ{\rm C} の場合の生存率を示します。 /\mathrm{min}\) 、露出時間の関数として。曝露時間が短い（50 秒未満）場合や過度に長い（70 秒以上）場合は、生存率が非常に低くなります。 (d) 最適暴露時間に対する加温速度の依存性。温暖化率が低い場合、回復率は 0% に近く、温暖化率が最も高い場合は 90% に達します。これらの結果はブレナーのプロトコルと比較する必要があり、最も良好な段階 (L1 ～ L2) ではわずか 35%、成人では 0% に近くなります。破線は結果の補間ではなく、傾向線です。 (e) 実験の 2D セクションにおける音圧の有限要素シミュレーション。最も高い音圧の領域である 270 dB は、トランスデューサの幾何学的焦点に達します。 (f) 温度場の有限要素によるシミュレーション。 HIFU に 60 秒間曝露した後の実験の 2D セクション。焦点では最高温度に達します。超音波と線虫の間の空隙を避けるために、ペトリ皿を逆さまに置き、黒い長方形が線虫を含むウェルを表します。 (g) 急速な再温暖化が不十分な後に死んだ線虫 (\(<150 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\))。 (h) HIFU 加熱により回復してから数時間後の線虫。あらゆる成長段階が評価されます。 (i) 線虫回収後の C. エレガンスの卵: それらの生殖能力は、凍結保存および HIFU 再加温後に保存されます。

これまでの詳細と検証をすべて乗り越えた後、C. elegans の実験段階に進みました。このため、線虫は、我々のニーズに合わせて、15% グリセロール中でのゆっくりとした凍結を使用する標準的なブレナーのプロトコル 53 に従って凍結保存されました。すべての成長段階の約 200 個体の個体群を、-\(0.6 \; ^\circ{\rm C} /min\) から - \(80 \; ^\circ{\rm C}\) まで冷却しました。上述のペトリ皿内に構築されたウェル内。このシステムで形成される氷の量については、補足情報で説明します。 − \(80 \; ^\circ{\rm C}\) で 48 時間保管した後、線虫を再び温めました。各実験には常に 2 つのプレートがありました。最初のプレートを超音波で再度温め、線虫がいるウェルの温度が約 - \(5 \; ^\circ{\rm C}\) (溶液の融点を超える温度) に達するまで超音波を適用しました。プロセス全体にわたる温度の変化を図 3a に示します。 2 番目のプレートを標準的な方法で再加温しました。線虫を含む溶液が完全に解凍されるまで、空気中に放置します (加温速度: \(\sim 10 \; ^\circ{\rm C}\)/分)。または、 \(37 \; ^\circ{\rm C}\) (加温速度: \(\sim 93 \; ^\circ{\rm C}\)/分) のウォーターバスに浸します。 1分。再び温めた後、虫を餌の入った皿の上に置きました。最後に、これらの回復は、それらを堆積した直後の移動性、24時間後の移動性、および繁殖能力を分析することによって観察されました。

10,000 匹を超える線虫を対象とした合計 53 回の HIFU 実験が実施されました。図4aに表示された表は、加温速度と超音波曝露時間に応じた生存率を示しています。図4のすべての温暖化速度は、- \(60\) から - \(40 \; ^\circ{\rm C}\) の範囲で測定されました。この間隔が選択されたのは、再結晶の問題がより重大になる可能性があるゾーンであるためです43,54。

超音波トランスデューサーには、13.6 W、33.9 W、90.5 W、134.4 W の 4 つの異なる電力が供給されました。このエネルギーの一部は電子機器で消費されました。熱電対で測定した関連する温暖化速度は \(14.2 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\)、\(31.7 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min }\)、\(157.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\)、および \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) です。後者が現在のシステムで達成可能な最大値であるため、これより高い速度を探索することはできません。

以下に示す結果の前に、一連の予備実験および探索実験が実施され、高い温暖化速度の利点の証拠が確認されました。このため、その後、より高い温暖化速度がより詳細に研究されました: \(157.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) と \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{分}\)。彼らについては、暴露時間の範囲を調査しました: \(157.8 \; ^\circ{\rm C} /min\) の場合は 30 秒、40 秒、50 秒、60 秒、70 秒、80 秒、40 秒、50 秒\(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) の場合、s、60 s、70 s、80 s、90 s。これらの実験の結果を図 4b と図 4c に示します。どちらの場合も、HIFUへの曝露時間が不十分または過剰であることが研究対象の集団にとって致命的であることが観察されています。

図 4b では、\(157.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) の温暖化速度に対応して、30 秒、40 秒、50 秒未満の曝露では、 s、回収率は0%です。 60 秒間上昇し、70 秒で最大値に達し、露出時間が長くなると再び下降し、最終的に 0% に達します (図示せず)。

同様に、図 4c では、\(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) の温暖化速度に対応し、40 秒未満の曝露では回復率は 0% です。露出時間が 40 秒、50 秒、60 秒と増加するにつれて、回復率は徐々に増加し、70 秒で最大に達します。露光時間のその値から、回復率はゼロになるまで再び低下します。

最後に、図4dでは、以前に見つかった最適な暴露時間の温暖化速度に対して生存率がプロットされています。このグラフは、生存率が最も低い温暖化率ではほぼ 0% から始まり、中程度の温暖化率 (\(157.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\)) では 20% まで上昇する様子を示しています。最も高い温暖化率では、最終的に 90% に達します (\(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\))。

成人に関しては、最適構成 \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) および曝露時間 70 秒の場合、プレートは 3 枚でした。この研究の残りのプレートと同様に、それぞれのプレートには約 200 匹の線虫が存在し、そのうち約 20 匹が成虫でした。超音波検査の結果、最悪の場合は成人 7 名、最良の場合は 10 名が発見され、成人の生存率はそれぞれ 40 ～ 50% でした。回収された成虫のビデオは補足情報で見ることができます（図S11）。従来のゆっくりとした復温では、成人の回復率は 0% に近いことに注意してください。

図4g～iはそれぞれ、不十分な温暖化速度によって死滅した線虫、\(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\で再温暖化した後のあらゆる年齢の線虫のグループ）の詳細を示しています。 ) 70 秒間、線虫の回復後に卵が短期間産まれました。

完全を期すために、\(37 \; ^\circ{\rm C}\) のお風呂と空気中 (室温: \(25 \; ^\circ{\rm C}) の 2 つの標準的な温め直しを行います。 \))、も登録されました。水浴中での生存率は 0% であり、Brenner の所見と一致しています 23 (この結果の議論については補足情報を参照)。空気の場合、回復率は L1 ～ L2 で約 35%、成人では 0% 近くであり、これも最近の研究と一致しています 51。

これらの観察は、凍結保存における再結晶化の問題を回避するために必要な昇温速度を達成する HIFU の能力を初めて証明したと結論付けることができます。この技術の利点は次のとおりです: (1) マイクロ波のような定常パターンを生成しない、(2) 熱暴走の問題がない、(3) 従来の凍結保護剤で既に保存されているサンプルにも使用できる、(4) MRI によってリアルタイムで監視でき、(5) 干渉計によって簡単に制御でき、(6) 他の多くの分野で日常的に使用されており、大きなメリットがあり、そして何よりも (7) は拡張可能です。これらすべてのことから、このアプローチは、単独で、またはナノ温暖化などの他の新興技術と組み合わせて、有望なツールとなります39。次に考えられるステップは、トランスデューサの数を増やし、X 線コンピュータ断層撮影と組み合わせて CPA フィールド/氷/亀裂を監視し、すでにある程度の成功を示しているシステムに適用することです。

C.エレガンスは動物モデルとして使用されています。私たちは、これが完全な臓器セットを備え、遺伝学、発生生物学、神経科学、腫瘍学の重要な発展の基礎となり、世界中の 500 以上の研究室で使用される理想的なシステムであると考えています。ここでのワームの使用は原則を証明するためだけです。しかし、たとえそうであっても、成体状態の保存、凍結が不十分な株、またはショウジョウバエの胚などの同様のサイズの構造にとって、それ自体は興味深いかもしれません55。いずれにせよ、私たちの技術は、臓器の冷凍保存を含め、再結晶化という遍在的な問題が現れる可能性のあるあらゆる状況に役立ちます。この分野での応用により、パラダイムシフトと臓器および組織のバンク化への新しい方法が期待されます。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、セビリア大学計画プロピオ・デ・インベストティガシオン・デ・ラ・ユニバーシダッド・デ・セビリア、科学技術省（スペイン）、AICIA、PEJUS-89、EQC2019-005949の助成金によって部分的に支援されました。フアン・ホセ・ヒメネスのエレクトロニクス分野での仕事に感謝します。また、この原稿の品質向上にご協力いただいた匿名の査読者にも感謝いたします。

高等工学部、C/Camino de los Descubrimientos s/n、セビリア大学、41092、セビリア、スペイン

エンリケ・アルカラ、ラウラ・エンカボ、ファティマ・バローゾ、アドリアナ・プエンテス、ラモン・リスコ

SafePreservation、C/Avda。 De la Ciencias 55、41020、セビリア、スペイン

イザベル・リスコ

National Accelerators Centre-US、JA、CSIC、C/Tomas Alva Edison 7、41092、セビリア、スペイン

ラモン・リスコ

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RR と IR は、再結晶化を避けるために HIFU のアイデアを考案しました。 EA と LE は冷却プロセスを実行しました。 EA と AP は超音波による撮影を行いました。 LE と FB がワームを維持しました。 EA が 3D デザインを作成しました。 EA と AP が焦点の決定を行いました。 EA はコンピューターシミュレーションを実行しました。 LE と FB が解決策を準備しました。 EA と LE は特別な寒天プレートを製造しました。 EA は統計分析を実行しました。 EA、LE、IR、RR がこの論文を執筆しました。 EA、LE、IR、RR はこれを批判的に解釈しました。 RRがチームを率いた。

ラモン・リスコへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足図10。

補足図11。

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転載と許可

アルカラ、E.、エンカボ、L.、バローゾ、F. 他。冷凍保存における再結晶の問題を解決するための音波。 Sci Rep 13、7603 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34681-z

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受信日: 2022 年 12 月 20 日

受理日: 2023 年 5 月 5 日

公開日: 2023 年 5 月 10 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34681-z

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